Fu fondato nel 1797 da Napoleone Bonaparte che, nella Costituzione della Repubblica Cisalpina (art. 297), stabilì la nascita di un Istituto Nazionale incaricato di raccogliere le scoperte e di perfezionare le arti e le scienze, su modello dell'Institut de France.

Nel 1810, Napoleone fissò la sede dell'Istituto Reale di Scienze, Lettere ed Arti, a Milano in palazzo Brera. Bologna, città prescelta come prima sede, divenne allora una sezione dell'Istituto milanese, insieme a Venezia, Padova e Verona. Negli anni napoleonici, oltre a svolgere attività di studio e di ricerca scientifica, l'Istituto fu punto di riferimento dell'azione governativa per l'istruzione pubblica, inferiore e superiore, e per l'università. L'Istituto, inoltre, destinò una parte dei fondi a sua disposizione all'istituzione di premi legati alla soluzione di problemi di medicina, scienze, arti, politica, di forte impatto pubblico.

Alla caduta di Napoleone, il Governo austriaco cambiò denominazione all'Istituto, che divenne allora Imperial Regio Istituto del Regno Lombardo-Veneto di Scienze, Lettere ed Arti. Nel 1838 l'Istituto Veneto divenne indipendente e i due Istituti, con vita autonoma, continuano a collaborare ancora oggi: l'Istituto Veneto con sede a Venezia e l'Istituto Lombardo con sede a Milano.

Nel 1859, nella Milano liberata dagli austriaci, l'Istituto acclamò quale suo presidente Alessandro Manzoni, che fu poi nominato presidente onorario.

Con decreto del 5 settembre 1863, Vittorio Emanuele II approvò il nuovo regolamento del Regio Istituto Lombardo di Scienze e Lettere, eliminando la menzione alle Arti, riservata alla Accademia di Belle Arti, pure presente in Brera. Furono stabilite due classi: Classe di scienze matematiche e naturali e Classe di lettere e scienze morali e politiche. Nei primi decenni del XX secolo e dopo la grande guerra, l'apertura e l'attenzione alle realtà sociali diventarono prioritarie nelle attività dell'Istituto; ma non minore fu l'attenzione per le applicazioni delle scoperte scientifiche a problemi di pubblica utilità.

Nel 1935 l'Istituto cessò di essere statale, ebbe un nuovo statuto e un'amministrazione autonoma, pur restando sotto il controllo del Ministero della Pubblica Istruzione prima e del Ministero per i Beni e le Attività culturali poi.

La guerra e i bombardamenti, che nel 1943 devastarono Milano, imposero una momentanea sospensione delle attività e delle adunanze; mentre le epurazioni fasciste videro l'allontanamento di alcuni membri dall'Istituto.